1 白玥,2 钟晓松,3 李文斌
肿瘤代谢与营养电子杂志. 2018, 5(2): 144-150.
目的 研究 MTX 对 RAS 蛋白定位改变以及下游信号途径的影响,并探讨 MTX 抑制人胶质母细胞瘤细胞株 U87 生长的可能机制。方法 不同浓度的MTX(75nmol/L、375nmol/L、750nmol/L、7,500nmol/L、15,000nmol/L)处理 U87细胞后, 采用MTT 法和FCM 法分别检测细胞活力,细胞凋亡率及细胞周期。RAS-GFP 和蛋白质印迹法分别检测RAS 蛋白的分布 定位和其下游MAPK/ERK 蛋白的表达水平。采用逆转录病毒法将RAS-GFP 融合基因转导至U87 细胞,共聚焦显微镜技 术能检测到RAS 活化后定位分布,与不同的MAKP/ERK 信号途径特异性抑制剂(U0126 和 PD98059)共培养,采用蛋白 质印迹法检测MTX 对 P-P42/P44 MARK 蛋白磷酸化水平的影响以及其调控转录因子c-MYC 表达水平发的影响。50nmol/L 的 MTX 处理 U87 细胞后,进一步用 FCM 法检测细胞表面分子 CD47 的表达水平。结果 不同浓度的 MTX(75nmol/L、 375nmol/L、750nmol/L、7,500nmol/L、15,000nmol/L)均能抑制人神经胶质母细胞瘤细胞株 U87 的增殖,呈剂量依赖性, 不同浓度的MTX 可将U87 细胞阻滞于个G2/S 期,并不能直接诱导细胞发生凋亡。转导RAS-GFP 融合基因到U87 细胞 (100% GFP),同对照组相比,用MTX 处理后发现RAS 蛋白从细胞膜转移到细胞质,从而通过降低或者抑制P-p42/p44 MARK 蛋白磷酸化水平(P < 0.05),以及抑制转录因子 c-MYC 的表达水平(P < 0.05),导致 U87 细胞生长受到抑制。 我们还近一步证明了 MTX 抑制与神经胶质母细胞瘤生长密切相关的细胞表面分子 CD47 在不同时间的表达水平。结论 我 们首次证明MTX通过改变RAS蛋白定位抑制MAPK/ERK/C-MYC信号导致神经胶质母细胞瘤U87细胞株的生长收到抑制, 细胞停滞在 G2/S 期,提示 MTX 有可能作为复发胶质瘤患者可选的治疗药物。